???2024年4月25日，《Cell》期刊在線發表題為《Generation of rat forebrain tissues in mice》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）楊輝組、周海波組、美國得克薩斯州西南醫學中心吳軍組、中國科學院動物所郭帆組合作完成。該研究提出了一個高效的異種囊胚互補系統并首次在小鼠體內生成了功能性的大鼠前腦組織，同時揭示了異種前腦補償嵌合體背景下細胞發育的自主性和非自主性性影響。這對于在進化背景下理解腦進化的機制具有重要意義。

????利用干細胞生成功能性的器官或組織一直是干細胞研究的熱點。異種囊胚互補技術使得在一物種內培育出另一種物種的器官或組織成為可能。該技術通過將多能干細胞注入到缺失關鍵發育基因的宿主囊胚中，由供體細胞補償宿主缺失的器官或組織，從而培育出源自另一物種的器官。先前研究已成功在小鼠中培育出大鼠的胰腺、胸腺、血管內皮組織和生殖細胞，同時在大鼠中也培育出小鼠的胰腺、腎臟和生殖細胞。盡管如此，目前尚未能在異種囊胚中培育出大腦組織。在一物種中培育另一種物種的大腦組織將有助于科研人員從進化的角度研究大腦的發育與功能。

????傳統的囊胚互補方法經常涉及構建影響特定器官發育的雜合基因突變小鼠，繁育這些小鼠以產生具有基因突變的囊胚，并將供體細胞注入這些突變囊胚中以形成囊胚互補嵌合體。這個過程不僅耗時耗力，且不適用于雜合致死的基因。利用傳統囊胚互補方法來驗證特定基因是否能支持某個器官的囊胚互補是一個漫長的過程。為解決這些限制，研究者引入了C-CRISPR（Cocktail of targeting sgRNAs in the CRISPR/Cas9 system）技術，這種技術通過使用多個gRNA結合Cas9來實現幾乎100%的基因敲除效率，從而避免了基因編輯動物的需要。研究者結合C-CRISPR和囊胚互補技術，創建了一個新的系統，稱為CCBC（C-CRISPR based Blastocyst Complementation），該系統允許快速驗證目標基因是否適合囊胚互補，并能一步生成器官重構嵌合體。

???研究者用CCBC系統篩選到了能夠支持前腦互補的基因Hesx1。通過C-CRISPR敲除小鼠受精卵里的Hesx1基因以阻止宿主細胞向前腦發育，讓受精卵發育到囊胚階段，然后分別向基因突變的小鼠囊胚腔里注射小鼠胚胎干細胞（Mouse embryonic stem cells,mESCs）或大鼠胚胎干細胞（Rat embryonic?stem cells,?rESCs）以補償宿主缺失的前腦組織。通過以上方法，研究者成功獲得了小鼠-小鼠前腦互補嵌合體（Hesx1^-/-??+mESCs）以及大鼠-小鼠前腦互補嵌合體（Hesx1^-/-??+rESCs）。

????所有Hesx1^-/-?+rESCs和Hesx1^-/-??+mESCs嵌合體都存活至成年，并呈現與傳統嵌合體（WT+mESCs）相似的體重生長曲線。在這些嵌合體的大腦皮層V層和海馬中，均檢測到表達CTIP2的細胞。在大腦皮層和海馬中，無論是Hesx1^-/-??+rESCs、WT+mESCs還是Hesx1^-/-??+mESCs嵌合體，其層厚度和細胞密度均相似。

????為了評估Hesx1^-/-?+rESCs嵌合體中大鼠神經元的功能，研究者向嵌合體前腦的前外側運動皮層注入了AAV8-hSyn-EGFP。實驗結果顯示，由rESC衍生的神經元能夠從這一區域向丘腦、上丘和腦干中腦區域投射軸突。電生理測試表明，這些嵌合前腦中的大鼠和小鼠皮層神經元可以隨著電流的增加發放不同頻率的動作電位。研究還確認，在Hesx1-/-?+rESCs嵌合體中，大鼠和小鼠細胞、小鼠與小鼠細胞、大鼠與大鼠細胞之間均能形成突觸連接。此外，研究通過行為學測試，包括Morris水迷宮實驗、開放場測試和情境恐懼記憶測試，評估了同種和異種前腦補償嵌合體的前腦功能。測試結果顯示，WT+mESCs、Hesx1^-/-??+rESCs和Hesx1^-/-??+mESCs嵌合體在這些行為測試中的表現無顯著差異，顯示重建的前腦功能表現正常。這些結果表明Hesx1^-/-?小鼠胚胎為供體rESCs提供了適宜的發育環境，幫助其形成功能性的大鼠前腦組織。

????皮層和海馬的單細胞RNA測序結果顯示大鼠細胞在Hesx1^-/-??+rESCs嵌合體中形成了多種類型的神經細胞，其種類和占比接近于WT大鼠的前腦組織。不同神經細胞類型下大鼠細胞的轉錄組更接近于WT大鼠細胞。有趣的是早期胚胎的切片結果顯示大鼠細胞形成的前腦組織的尺寸和發育進度與宿主小鼠一致。這表明非細胞自主機制決定了器官的大小和發育速度，而細胞自主機制塑造了嵌合體中大鼠前腦組織的整體轉錄組特征。

????通過比較大鼠細胞在嵌合體與WT大鼠中的轉錄組差異，研究者發現了一些與軸突生成、前腦發育和神經生成調控等相關的差異表達基因。通過細胞相互作用分析，該研究觀察到了多種潛在的配體-受體相互作用，這可能解釋了宿主Hesx1^-/-?小鼠細胞如何影響供體大鼠細胞，以及幫助它們在前腦中的存活和分化。

????腦智卓越中心楊輝/周海波研究員、美國得克薩斯州西南醫學中心終身教授吳軍和中國科學院動物所郭帆研究員為該論文通訊作者。得克薩斯州西南醫學中心博士后黃佳、賀冰冰、李磊杰，農科院深圳農業基因組研究所博士生楊霞麗，中國科學院動物所博士生龍鑫以及腦智卓越中心博士后魏迎輝為該論文的共同第一作者。

圖1.通過CCBC在小鼠體內生成大鼠前腦組織。A: 基于CCBC的異種前腦互補嵌合體；B: 表達tdTomato的大鼠細胞對前腦組織的嵌合占比。